筛靶就找达吉特。小分子药物进行靶点筛选是进行小分子药理解释、小分子减毒增效改造乃至开发出新药的重要基础。中药小分子往往被作为开发新药的先导化合物，其普遍具有多靶点多功效的特性，找到并明确中药小分子的药效靶点对于新药开发领域具有重要意义。达吉特在小分子靶点筛选实验中，主要提供两大类，一类是基于修饰策略的靶点筛选，主要是对小分子进行生物素或者炔基修饰；一类是非修饰策略。由于非修饰策略方案均受到结合原理的限制，目前以生物素标记和炔基标记的靶点筛选策略仍是小分子靶点发现的主流技术。下面就针对常用的八种靶点筛选方法进行详细介绍。

方案一：基于生物素修饰--20K人类蛋白组芯片

技术原理：芯片上有超过2万种人类全长蛋白质，覆盖81%的人类基因组ORF区，是目前世界上通量最高的蛋白质芯片。将带有生物素标记的小分子与20K芯片共同孵育，再引入带有CY3或CY5荧光的链霉亲和素，通过检测芯片上的荧光信号，即可确定小分子的直接结合靶蛋白。相比于传统靶点筛选技术，能够获取小分子的直接结合靶点蛋白，筛选更加高效和准确。此外，采用20K人类蛋白组芯片就进行靶点筛选，还能解决传统方法中由于蛋白丰度低而难以捕捉的药-靶结合问题。利用一次芯片实验能够确定多个小分子的直接结合靶点蛋白，具有极高的性价比，其技术优势不可替代。

方案二：基于生物素修饰--GPCR膜蛋白芯片

关于膜蛋白靶点筛选我们可以选用GPCR膜蛋白芯片。GPCR膜蛋白芯片是先在单纯疱疹病毒（HSV-1）上表达GPCR，经过宿主细胞的复制后，将病毒粒子纯化出来点制在三维立体修饰的芯片片基上，因此GPCR膜蛋白在病毒磷脂双分子层的支持下可保持完整的活性结构。这种方法消除了使用传统方法研究GPCR膜蛋白时引起的内源性细胞受体的问题，避免了基于细胞的结合分析限制，并且能够展现出更清晰的数据。目前该芯片上共包含400多种常见药靶膜蛋白。GPCR膜蛋白芯片进行靶点筛选能够筛选到直接结合的膜蛋白靶点，假阳性率较低；且采用荧光检测结合反应，检测灵敏度更高。

方案三：基于生物素修饰--Pull down+MS

小分子靶点筛选的Pull down实验是一种有效的筛选药物与潜在靶蛋白之间相互作用的体外技术。利用生物分子之间的亲和力原理，将生物素标记的小分子化合物固定在链霉亲和素的磁珠上，与蛋白裂解液进行孵育，孵育结束后与小分子结合的蛋白可以通过质谱检测，将下游的靶点蛋白鉴定出来。该方法简单易行，操作方便，在药靶筛选方面已得到广泛的应用。

方案四：基于炔基修饰--ABPP基于炔基标记的点击化学技术

ABPP（Activity-Based Protein Profiling）是在点击化学和LC-MS质谱基础上发展起来的小分子化合物靶点筛选技术。将小分子进行炔基标记后处理细胞，通过简便高效的点击化学反应，将结合上靶点蛋白的炔基小分子连接到带有叠氮的磁珠上，通过磁珠离心获取小分子靶向结合的靶点蛋白。进一步，通过LC-MS分析出小分子的潜在靶点蛋白。ABPP的独特技术特点在于炔基修饰对小分子的活性和结构影响低，可以在活细胞水平上进行靶点筛选，更接近真实的生物学条件。

方案五：基于生物素修饰--SPIDER基于邻近标记技术的膜蛋白靶点筛选

SPIDER技术的原理基于结核分枝杆菌类泛素蛋白酶体系统中底物Pup分子在体外能够招募PafA连接酶发挥邻近标记作用。将小分子进行生物素标记后处理活细胞，加入SPIDER 系统，在结核分枝杆菌类泛素化连接酶PafA的催化下，PupE的C末端与靶蛋白表面的赖氨酸残基共价相连，形成类泛素连接反应，进一步，通质谱分析出小分子的潜在靶点蛋白。

该技术十分适用于筛选小分子的膜蛋白靶点筛选，主要是因为该技术能够在活细胞水平上进行靶点筛选，从而保证膜蛋白的活性和构象；此外该技术可以将小分子与互作蛋白转为共价结合，形成类泛素化连接反应，牢牢抓住小分子与膜蛋白结合的信息，这也使得后续可以使用严苛的洗脱条件从而有效降低非特异性干扰，使得结果更灵敏、更特异、更稳定。

方案六：非修饰策略--DARTS药物亲和反应靶向稳定性技术

DARTS技术是基于蛋白的酶解稳定原理，即小分子与蛋白结合后，可能使蛋白的结构发生解旋或聚集，从而使蛋白对广谱的蛋白酶变得更加耐受或敏感。通过SDS-PAGE分离，进行实验组和对照组的条带比较，最后进行质谱鉴定，即可得到小分子的潜在靶点蛋白。该方法操作简便，可适用于大多数小分子化合物，同时适用于复方、混合物以及菌种等体系的靶点筛选。但是由于其技术原理的限制，不适用于在自然条件下抵抗蛋白质水解的蛋白质或蛋白质结构域。

方案七：非修饰策略--LiP-MS限制性酶解-质谱分析技术

该技术是一种基于有限蛋白酶切的化合物靶点筛选技术，其独特之处在于无需对化合物进行修饰即可实现对特定化合物结合肽段进行筛选。小分子与靶点蛋白结合后，会形成空间位阻，防止蛋白酶K等广谱蛋白酶对靶点蛋白特定多肽位点的水解。进一步利用胰酶在精氨酸和赖氨酸特定位点消化所有蛋白质后再进行质谱检测。通过对蛋白酶K和胰酶切割差异化位点的分析，可以找到小分子作用的差异性肽段。基于技术原理，LiP-MS技术更适用于小分子量代谢产物的靶点筛选研究。

方案八：非修饰策略--CETSA细胞热转移技术

该技术基于蛋白的热稳定性原理进行靶点筛选，即小分子与靶点蛋白结合后会增强靶点蛋白的热稳定性。随着温度的升高，部分蛋白会逐渐降解。相同温度下，结合了药物的蛋白质具有更高的热稳定性，相比未结合药物的蛋白质，未降解蛋白的量会提高，同时该复合蛋白的热熔曲线发生改变，进一步通过质谱鉴定到小分子的潜在靶点蛋白。由于其技术原理的限制，不适用于在自然条件下不受温度影响的蛋白质或蛋白质结构域。该技术也是目前非修饰策略技术中灵敏度最高一个靶点筛选技术。

以上就是所有靶点筛选技术的整体介绍，每个技术都有各自的优势，可以依据自己的需求进行选择。如有需求欢迎访问达吉特官网www.tgtmed.com做进一步咨询！