蛋白质是生命活动的核心执行者，参与信号传导、代谢调控、免疫应答等几乎所有的生物过程。在精准医学时代，深入解析蛋白质的身份、结构与功能，不仅是基础科研的重要内容，更是推动生物医药创新的基石。从新药靶点发现、疾病机制研究，到生物药质量控制和临床诊断，蛋白质鉴定技术在科研与产业中都扮演着不可替代的角色。
在众多分析策略中，肽图分析（Peptide Mapping）与二级质谱蛋白鉴定（LC-MS/MS Protein Identification）是应用最广、互补性最强的两种技术。它们的共同目标是为蛋白质建立“身份档案”，但在技术原理、数据类型、信息深度和应用场景上各有特色。肽图分析擅长在有参考序列的情况下进行结构一致性验证，是生物药质量控制的“金标准”；而LC-MS/MS则能够在无先验序列的条件下，通过序列解析实现未知蛋白鉴定，并提供全面的结构与修饰信息。
一、肽图分析（Peptide Mapping）
肽图分析是一种利用特异性酶切后结合色谱或质谱分析，验证蛋白质一级结构和一致性的技术。在控制条件下，蛋白质会被切割成一组具有特定序列和理化性质的肽段。这些肽段在色谱保留时间与质荷比（m/z）上的分布模式具有高度一致性，因此被形象地称为蛋白质的“指纹图谱”。通过将样品获得的肽图与参考标准进行精确比对，可以判断它们在氨基酸序列、翻译后修饰以及结构完整性方面是否一致，从而为蛋白质的身份确认和质量监控提供可靠依据。
图1. 肽图分析流程
方法在质谱检测环节中通常依赖高分辨率精确质量（HRAM）质谱仪，如 Orbitrap 和四极杆飞行时间质谱（Q-TOF），以确保长期运行中的质量精度（优于 1–5 ppm）和分辨率（Orbitrap 可达 500,000+ FWHM，Q-TOF 稳定在 30,000–60,000 FWHM）。其原理是将经液相色谱分离的肽段通过电喷雾电离（ESI）导入质谱分析器，精确测量质荷比（m/z）和信号强度，并结合保留时间生成二维肽指纹（Retention Time × m/z）。在固定酶切和分析条件下，不同蛋白会呈现高度一致的肽段组合与峰型特征，就像人的指纹一样。这种一致性和可重复性，使肽图分析成为生物药质量一致性评价、批次比对和结构稳定性研究的金标准。
1、优势
（1）高度重复性：固定酶切和分离条件下生成的肽指纹模式稳定可复现，适合批次一致性对比。
（2）结构一致性验证：可快速判断氨基酸序列、降解产物及翻译后修饰变化，适合生物药质量控制。
（3）流程简洁：主要依赖MS1数据，仪器和数据处理要求相对较低，分析周期短。
（4）适合长期监测：可在生产、储存、运输全过程对蛋白结构变化进行追踪。
2、不足
（1）依赖已知序列：必须有参考标准或已知序列才能比对，不适用于未知蛋白。
（2）信息深度有限：无法解析完整序列，修饰检测能力有限。
（3）对复杂样品适应性差：不适合背景信号高或蛋白种类多的混合物。
二、二级质谱蛋白鉴定（LC-MS/MS Protein Identification）
当目标蛋白未知或样品成分复杂时，二级质谱蛋白鉴定则是更优选择。在二级质谱蛋白鉴定（LC-MS/MS）中，首先使用特异性蛋白酶将蛋白质切割成肽段，经液相色谱分离后依次进入质谱仪进行两级检测。一级质谱（MS1）精确记录每条肽段的质荷比（m/z）和丰度信息，然后选取特定肽段进入二级质谱（MS2）进行序列解析。在MS2阶段，肽段通过碰撞诱导解离（CID）与惰性气体分子（如氮气或氦气）碰撞，使肽键在多个可能位置断裂。虽然理论上可能产生多种碎裂类型，但在CID条件下，b系列离子（带正电荷并保留N端）与y系列离子（带正电荷并保留C端）最为常见且最具分析价值。通过解析这些碎片离子的m/z分布，即可推断肽段的氨基酸顺序，并与蛋白质数据库比对，从而在无参考标准的情况下实现对复杂体系中已知与未知蛋白的全面鉴定，同时可精确定位多种翻译后修饰。
Kolker, E. et al. Trends Microbiol. 2006.
图2. 二级质谱蛋白鉴定流程
LC-MS/MS 不仅能同时鉴定和定量数千种蛋白，还可精确定位多种翻译后修饰（如磷酸化、乙酰化、糖基化等），大幅拓展了蛋白质组学的研究深度与广度。
1、优势
（1）无需先验序列：可直接通过CID碎片离子推断肽段序列，适用于未知蛋白鉴定。
（2）高通量分析：一次可鉴定和定量数千种蛋白，覆盖度和信息量远高于肽图分析。
（3）修饰定位精准：可精确检测和定位多种翻译后修饰（如磷酸化、乙酰化、糖基化等）。
（4）广泛适用：可用于复杂混合物、生物体液、组织、单细胞等样品。
2、不足
（1）数据处理复杂：依赖大型数据库和高性能计算，分析周期长。
（2）对样品要求高：消化效率、纯度和前处理条件对结果影响显著。
（3）数据库依赖性：未知物种或不完整数据库可能导致漏检或误检。
图3. 肽图分析与LC-MS/MS蛋白鉴定的差异
肽图分析擅长已知蛋白的批次一致性与质量监控，而 LC-MS/MS 则在未知样品鉴定和深入结构解析方面独具优势。在实际科研与产业应用中，这两种技术往往是互补的：先用肽图分析确认目标蛋白的身份与一致性，再用 LC-MS/MS 对样品进行全面成分解析和修饰定位，从而在不同研究阶段提供最合适的技术支持。
关于我们
北京百泰派克生物科技有限公司致力于为生物/制药和医疗器械行业提供质量控制检测和项目验证等专业服务。公司实验室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法规和指导原则，通过CNAS/ISO9001双重质量体系认证，建立了完备的质量体系，数据冷热/异地备份，设备定期计量/期间核查，软件审计追踪，为客户提供一体化解决方案和技术服务，支持新药研发、药物申报注册和生产放行。
1.公司采用ISO9001质量控制体系，专业提供以质谱为基础的CRO检测分析服务；
2.获国家CNAS实验室认可，为客户提供符合全球药政法规的药物质量研究服务；
3.业务范围覆盖蛋白质组学、多肽组学、代谢组学、生物药物表征、单细胞分析、单细胞质谱流式、生信云分析以及多组学生物质谱整合分析等；
4.七大质量控制检测平台，满足您一站式服务需求；
5.服务3000+企业，10000+客户的选择；
6.致力于为您提供优质的生物质谱分析服务!