Illumina Human 甲基化450K芯片服务

一、芯片介绍

探针覆盖范围广泛：每张芯片 包含 45万 个 CpG 位点 ，24846个基因来自于CCDS，2000多个 癌症相关基因、 400 个miRNA 基因启动子区 ，300个甲基化热点区。全面覆盖基因的启动子区域、5`UTR、第一个exon、基因内部、3`UTR，全面覆盖CpG island、CpG shores、CpG shelves；并且覆盖了科学家们研究发现的一些其它重点区域，如：CpG island以外的CpG位点、在人类干细胞中观察到的非CpG岛甲基化位点、多种肿瘤样品与正常样品以及不同组织之间有差异的甲基化位点、miRNA启动子区域以及GWAS项目发现的疾病相关区域位点、FANTOM 4 启动子等。

实现高通量、定量检测：可以同时检测>450，000个位点，并在单位点水平上进行定量检测，可以分析单个样品的甲基化修饰程度，也可以比较不同样品或样品组之间的甲基化修饰水平的差异。

高质量的实验数据：采用Infinium技术，无需PCR反应，不依赖限制性内切酶，芯片反应通过等位基因特异性延伸来完成，保证了高质量的实验数据。

2.实验流程：

 在亚硫酸氢盐的处理下，没有甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U）；甲基化的胞嘧啶则不受影响。

3.Illumina Human 甲基化450K芯片的优势： 
 A. 覆盖全面：450,000多个甲基化位点； 
 B. 无需“甲基化DNA免疫共沉淀”，亚硫酸氢盐处理基因组DNA即可进行芯片实验； 
 C. Infinium探针设计，直接识别甲基化位点； 
 D. 技术重复相关系数R2 = 0.9969； 
 E. 与“全基因组亚硫酸氢盐-测序”相关系数R2 > 0.959。 

4.芯片原理（探针设计）： 

      Illumina Human 甲基化450K芯片采用IlluminaBeadArrayTMInfinium技术，特异性的识别甲基化位点。在甲基化450K芯片中，同时采用了InfiniumⅠ 和InfiniumⅡ 探针设计，从而使得检测范围最大化。

 （1）InfiniumⅠ 探针设计

      对于每个甲基化位点，都对应设计有两种探针：M型磁珠、U型磁珠。M型磁珠尾部为G，用来检测甲基化位点。U型磁珠尾部为A，用来检测未甲基化位点。 

      基因组上的某一位点，如果被甲基化了，那么在亚硫酸氢盐的处理下，GC仍为GC，与M型磁珠配对，荧光标记的核苷酸掺入后能被检测到荧光信号。M型磁珠发光。反之，如果没有被甲基化，那么在亚硫酸氢盐的处理下，GC变为GT，与U型磁珠配对，延伸后U型磁珠发光。

（2）InfiniumⅡ 探针设计

      InfiniumⅡ 探针只使用一种磁珠，探针末端为C。配对后只掺入单个碱基（ ddNTP-BioT， ddNTP-DNP）。根据荧光类型判断掺入的碱基类型，从而判断是否被甲基化。 
      目前，Human甲基化450K芯片大多数探针都是InfiniumⅡ 探针。
二、您需要给我们提供：
样品类型：组织、细胞、基因组DNA（ > 3微克） 

样品要求： 
1. 样品纯度：OD 260/280值应在1.7～2.0 之间；RNA 应该去除干净；不得有其它个体或其它物种的DNA污染。 
2. 样品浓度：浓度不低于55ng/μl； 
3. 样品总量：每个样品总量不少于5μg 。 
4．样品溶剂：溶解在TE中。 
5. 样品运输： DNA低温运输（-20℃）；在运输过程中请用parafilm将管口密封好，以防出现污染。

三、我们能给您提供：

 四、DNA甲基化芯片数据分析方案

1. 差异甲基化的筛选 

2.聚类 分析
为了展示甲基化水平在样本中高低甲基化的分布，用甲基化水平的 值来做聚类图的展示。

3. 差异甲基化基因的功能分析 

        GO-Analysis对差异甲基化基因等按GO分类，并对分类结果进行基于离散分布的显著性分析、误判率分析、富集度分析，得出与实验目的有显著联系的、低误判率的、靶向性的基因功能分类，该分类即导致样本性状差异的重要的差别。通过该分析有可能找到导致甲基化水平变化的重要功能，并且找到该功能所对应的基因。

4. 差异甲基化基因的pathway分析 
信号通路（Pathway）是多个蛋白质间相互作用，共同调节细胞功能和代谢活动的过程。而信号通路分析是通过对差异基因按照Pathway的主要公共数据库KEGG和Biocarta来进行分类，对Pathway中的基因进行基于离散分布的显著性分析，得到与实验目的有显著联系的Pathway 分类,该分类即导致样本性状差异的最重要Pathway。 

5. 甲基化芯片与表达谱芯片联合分析 
甲基化芯片除了常规的散点、差异性分析、聚类、GO和Pathway等都可以做之外，在联合分析可以找到与甲基化负相关的mRNA。

五、应用案例：基因芯片研究肾上腺皮质肿瘤甲基化谱 
      肾上腺皮质肿瘤是肾上腺皮质细胞发生的一种肿瘤，大多数为良性的腺瘤，少数为恶性的肿瘤。以往的研究并不确定在肾上腺皮质肿瘤的发生过程中是否有甲基化谱的改变。在本研究中，科学家们利用DNA甲基化芯片分析了正常组织、腺瘤、原发性恶性肿瘤、转移性恶性肿瘤样品之间甲基化谱的差异。结果发现，四种样品之间存在明显的甲基化谱差异，恶性肿瘤组织存在广泛的低甲基化现象，而且不同信号通路的甲基化水平不同。

甲基化芯片结果聚类分析

原文：Rechache et al. DNA Methylation Profiling Identifies Global Methylation Differences and Markers of Adrenocortical Tumors. J ClinEndocrinolMetab, June 2012, 97(6)