LncRNA芯片/LncPath™芯片技术服务

一、LncRNA芯片技术服务 

       长链非编码RNA (LncRNA) 是一类长度超过200nt的RNA，它们本身并不编码蛋白，而是以RNA的形式在多种层面上（表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等）调控基因的表达水平。近年来的研究表明：LncRNA广泛参与各种生物学过程，LncRNA的异常表达与包括癌症在内的多种疾病密切相关。通过LncRNA芯片，研究人员能够快速高通量的获得与特定生物学过程或者疾病相关的LncRNA的表达变化，从而为后续的LncRNA功能研究或生物标志物筛选提供极大的便利。
       Arraystar LncRNA芯片可同时检测LncRNA和mRNA，这一突破性芯片平台的构建，使Arraystar成为LncRNA研究领域的先驱和领导者。迄今为止，采用Arraystar LncRNA芯片已发表的SCI论文已超50篇，其中多篇发表在Mol Cell，Hepatology，Blood，EMBO等国际顶尖杂志上。

 Arraystar公司LncRNA芯片产品列表

 Arraystar LncRNA Array芯片特点

    Arrystar LncRNA芯片平台采用了一种灵活，高效的aRNA标记方法，不但可以同时标记带PolyA尾巴和不带PolyA尾巴的RNA转录本，而且对低丰度或部分降解的RNA转录本的检测灵敏度比传统方法高100倍以上。

康成生物LncRNA芯片技术服务实验流程
1. 样品总RNA抽提
    若实验对象为组织样品，取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），匀浆后抽提RNA。
    若实验对象为细胞样品，每份样品取1×10⁶~1×10⁷细胞，完全吸去培养液后加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA。
2. RNA质量检测
    使用Nanodrop测定RNA在分光光度计260nm、280nm和230nm的吸收值，以计算浓度并评估纯度。
    使用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度及完整性
3. cDNA样品合成和标记
4. 标记效率质量检测
    使用Nanodrop检测荧光标记效率，以保证后续芯片实验结果的可靠性。
5. 芯片杂交
    在标准条件下将标记好的探针和高密度芯片进行杂交。
6. 图像采集和数据分析
    使用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，并将实验结果转换成数字型数据保存，使用配套软件对原始数据进行分析运算。
7. 提供实验报告
    芯片扫描图
    实验方法中英文报告
    RNA质检报告
    芯片数据结果报告，包括差异表达LncRNA列表，差异表达基因列表

               常规lncRNA芯片研究流程

康成客户实例——Arraystar LncRNA表达谱芯片
Repression of the long noncoding RNA-LET by histone deacetylase 3 contributes to hypoxia-mediated metastasis. Molecular Cell. 2013.
使用芯片： Arraystar Human LncRNA Microarray
    研究者通过 Arraystar Human LncRNA芯片筛查到了在肝细胞癌中特异性低表达的LncRNA分子（LncRNA-LET），并在大规模临床样本中利用实时定量PCR实验发现该LncRNA分子在肝细胞癌、结肠癌和鳞状细胞肺癌中都有特异性低表达；进一步的研究表明该LncRNA的显著下调由缺氧性组蛋白脱乙酰化酶3介导，并通过调节NF90蛋白影响癌细胞转移。本研究首次在分子机制的角度阐述了缺氧、组蛋白乙酰化、LncRNA分子和癌细胞转移之间的关系，找到了新的影响癌细胞转移的治疗靶点，有着重大的生物和临床意义。

HBx-related lncRNA Dreh inhibits hepatocellular carcinoma metastasis by targeting the intermediate filament protein vimentin. Hepatology. 2012.
使用芯片：Arraystar Mouse LncRNA Microarray
    研究人员利用Arraystar Mouse LncRNA芯片在HBx转基因小鼠肝脏中筛选出差异表达的LncRNA，其中LncRNA.Dreh (AK050349)表达量在所有年龄和性别的转基因小鼠中都显著下调。对LncRNA.Dreh进行深入研究发现，LncRNA.Dreh能结合中间丝蛋白并抑制其表达，通过改变细胞骨架结构和形态，抑制癌细胞的增殖和转移。对50例临床样本(肝癌组织v.s.癌旁组织)的研究发现：该分子在癌组织中表达量比正常组织低，并且和病人的预后相关，LncRNA.Dreh表达量高的病人复发率低并且生存期长。该研究首次将乙肝病毒自身表达的HBx蛋白和肝脏组织中的LncRNA关联起来，找到了新的肝癌预后标志物，有着重大的临床意义。

Long non-coding RNA high expressed in hepatocellular carcinoma (LncRNA-HEIH) facilitates tumor growth through enhancer of zeste homolog 2. Hepatology. 2011
使用芯片： Arraystar Human LncRNA Microarray
    研究者首先通过LncRNA芯片实验和RT-PCR验证，在5例肝癌组织与5例癌旁组织样本中找到了一个肝癌细胞高表达的LncRNA（LncRNA-HEIH），并且在大量样本（50例肝癌和正常组织，20例肝硬化组织和正常肝组织）验证了LncRNA-HEIH的特异性。通过基因共表达网络图和病人生存时间等临床数据关联分析，发现LncRNA-HEIH可以作为一个独立的判断HCC病人生存时间的预后指标。一般LncRNA-HEIH表达越高，HCC病人的预后越差。然后研究人员对LncRNA-HEIH的功能展开了深入的研究。首先利用过表达技术（gain of function ）和RNAi技术（loss of fuction）发现LncRNA-HEIH能促进细胞增殖，在细胞周期调控过程中起重要作用。RNA免疫共沉淀和ChIP等实验揭示了LncRNA-HEIH可以通过结合EZH2招募PRC2，进而抑制下游靶基因的表达，实现调控细胞周期的功能。这些结果提示在肝细胞癌症发生过程中，LncRNA-HEIH可能是一个重要的调控“枢纽”。

上图：肝癌（n=5）和癌旁组织（n=5）的芯片聚类结果。Arraystar公司的lncRNA芯片同时设计了mRNA与lncRNA，图A为差异表达的254个mRNA聚类结果，图B为差异表达的174个lncRNA聚类结果。红色代表上调，绿色代表下调。

二、LncPath^TM 芯片技术服务

LncPath^TM疾病/信号通路特异性LncRNA芯片特色 
•  对疾病/信号通路特异性LncRNA可靠的收集
•  快速的建立LncRNA调控机制与其生物学功能之间的联系
•  图形化的展示LncRNA及其靶基因的信息
•  创新性的探针设计
•  高效、稳定的标记系统
•  可靠的芯片性能
•  聚焦于与疾病或信号通路相关的少量LncRNA和mRNA，使得数据分析流程更加快速，精准。

对疾病/信号通路特异性LncRNA可靠的收集
    LncPath^TM芯片通过整合权威数据库，经典文献和Arraystar LncRNA数据库等资源，对疾病/信号通路特异性的LncRNA进行了全面，可靠的收集，涵盖的LncRNA主要有：1）疾病/信号通路特异性蛋白编码基因的邻近LncRNAs； 2） 疾病/信号通路特异性蛋白编码基因的长链非编码ceRNAs； 3） 已知的与特定疾病或信号通路相关的LncRNAs。

图1. LncPath^TM芯片的LncRNA收集流程。

快速的建立LncRNA调控机制与其生物学功能之间的联系
    LncPath^TM芯片可以同时检测与特定疾病或信号通路相关的LncRNA以及相应的靶基因，并且对LncRNA和靶基因的关系进行了详细的注释，能够帮助客户快速的将LncRNA的调控机制与其在特定的信号通路或疾病中的生物学功能联系起来。

图2. 通过LncPath^TM芯片建立LncRNA的调控机制与其生物学功能之间的联系。

图形化的展示LncRNA及其靶基因的信息
    LncPath^TM芯片提供LncRNA及其靶基因信息的图形化展示，通过图形化展示客户可以迅速了解LncRNA及其靶基因的关系（图3），方便后续的机制和功能研究，这些图形化展示结果都可以通过Arraystar网站免费获得。

图3. 可能调控WNT信号通路中的关键基因CCND2的LncRNAs详细信息。

创新性的探针设计
    LncPath^TM芯片采用了创新性的探针设计：针对每个LncRNA设计转录本特异的LncRNA探针，保证对LncRNA的准确检测。针对每个蛋白编码基因设计两种探针：基因探针和转录本特异性探针。基因探针用于检测基因水平的表达情况，它的信号可以用来表征邻近LncRNA或其它LncRNA通过转录调控机制对此蛋白编码基因的影响。转录本特异性探针用于检测此基因的经典转录本的表达，它的信号可以用来表征长链非编码ceRNA或其它LncRNA通过转录后调控机制对此蛋白编码基因的影响（图4）。

图4. LncRNA探针：转录本特异性探针，可以准确的检测LncRNA；
      基因探针：用于检测蛋白编码基因在基因水平的表达情况。它的信号可以用来表征邻近LncRNA或其它LncRNA通过转录调控机制对此蛋白编码基因的影响。
      转录本特异性探针：用于检测蛋白编码基因在转录本水平的表达情况。它的信号可以用来表征长链非编码ceRNA或其它LncRNA通过转录后调控机制对此蛋白编码基因的影响。

高效、稳定的标记系统
    LncPath^TM芯片采用了一种高效，灵活的标记系统（图5）。这种标记方法不但可以同时标记带PolyA尾巴和不带PolyA尾巴的转录本，还可以极大的增加低丰度RNA和降解RNA的cRNA产率，灵敏度比常规标记方法高100倍以上。

图5. 高效，灵活的标记系统。

可靠的芯片性能
高灵敏度：能准确检测跨域5个数量级的低丰度RNA （图6）

图6. LncPath^TM芯片具有跨越超过5个数量级的检测范围。横轴代表Spike-in浓度的log值，纵轴表示Spike-in芯片信号（log2转化后）。

高重复性：Arraystar circRNA 芯片实验的技术重复组之间具有很好的相关性（R2>0.9）（图7）

图7. LncPath^TM芯片技术重复间的散点图。分别用同样的样品在不同两天进行芯片标记和杂交反应，并根据芯片信号做出散点图，从图中可以看出：芯片间的相关性非常高（R2>0.9），说明LncPath^TM芯片平台重复性很好，非常稳定。

LncPath^TM疾病/信号通路特异性LncRNA芯片应用思路

 康成生物疾病/信号通路特异性LncRNA芯片技术服务流程

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