microRNA(miRNA)实时定量PCR技术服务
产品名称： microRNA(miRNA)实时定量PCR技术服务
英文名称： microRNA(miRNA) Real-time PCR Service
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上海康成生物工程有限公司
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microRNA实时定量PCR技术服务
实时荧光定量PCR技术是在普通PCR反应体系中加入荧光试剂，利用荧光信号实时检测PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR能够专一、灵敏、快速、高重复性地精确定量起始模板浓度。成熟microRNA是由21-25个核苷酸组成的小RNA，由于长度太短，不能通过传统的实时定量PCR进行检测。本公司通过特殊设计的茎环结构的反转录引物，配合实时定量PCR引物及探针可以精确检测微量样品中microRNA表达水平，也可以用终点PCR法定性检测。
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康成生物为您提供microRNA实时定量PCR技术服务，您只需要提供保存完好的组织或细胞标本，本公司专业的技术服务人员就可替您完成microRNA实时定量PCR实验操作和数据分析，提供给您完整的实验报告，为您节省大量的时间和精力。 |
康成客户实例——microRNA qPCR
Signature microRNA Expression Profile of Essential Hypertension and Its Novel Link to Human Cytomegalovirus Infection. Circulation, 2011.
研究者首先采用Exiqon miRCURY LNA™芯片(v11.0)检测13例高血压患者和5例健康人血浆样本的microRNA表达谱，发现27个表达差异的microRNA。随后对第二组24例高血压患者和22例健康人的血浆样本，应用实时定量PCR方法对芯片筛选出的表达有变化的microRNA进行验证（见下图）。PCR结果和芯片结果一致。并进一步在第三组，194例高血压患者和97例健康人的血浆样本中应用实时定量PCR方法对挑选出的重要microRNA进行检测。发现与健康人相比，HCMV编码的hcmv-miR-UL112在高血压患者的血浆中表达明显上调。
上图： microRNA qPCR验证microRNA芯片数据。从microRNA芯片数据挑选了20个差异表达的microRNA，利用荧光定量PCR进行验证，结果显示与microRNA芯片得出的表达趋势基本一致。红色表示健康人样本，绿色表示高血压病人样本，microRNA的表达量经过snRNA U6归一化。
康成生物microRNA实时定量PCR技术服务流程
1. 引物设计、合成
设计并合成目的microRNA的茎环RT引物、PCR引物和检测用荧光探针，并合成该microRNA相应的DNA寡核苷酸作为标准。
2. 样品RNA抽提
a．组织样品：取适量（50～100mg）新鲜组织或正确保存的组织样品，匀浆后用PURELINKTM试剂抽提RNA。
b．细胞样品：取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，吸去PBS后用PURELINKTM试剂抽提RNA。
3. RNA质量检测
a．紫外吸收测定法测定RNA在波长260nm和280nm的吸收值，获得RNA的浓度并通过A260/280及A260/230的吸收比值判断RNA的纯度。
设计并合成目的microRNA的茎环RT引物、PCR引物和检测用荧光探针，并合成该microRNA相应的DNA寡核苷酸作为标准。
2. 样品RNA抽提
a．组织样品：取适量（50～100mg）新鲜组织或正确保存的组织样品，匀浆后用PURELINKTM试剂抽提RNA。
b．细胞样品：取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，吸去PBS后用PURELINKTM试剂抽提RNA。
3. RNA质量检测
a．紫外吸收测定法测定RNA在波长260nm和280nm的吸收值，获得RNA的浓度并通过A260/280及A260/230的吸收比值判断RNA的纯度。
b．甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度和完整性。
注：用于microRNA实时定量PCR检测的RNA样品，必须高纯度、完整，没有RNase 污染（降解的样品不能用于实时定量PCR检测），同时提取方法必须保证所得样品包含完整的小RNA部分。
4. 逆转录合成cDNA
利用茎环引物逆转录合成cDNA第一链。
5. 实时定量PCR
以合成的cDNA作为模板进行实时定量PCR扩增，梯度稀释的标准同时进行实时定量PCR扩增，根据Ct值制备标准曲线。以同样的方法测定每个样品中U6 snRNA含量作为内参，校正上样误差。
6. 分析结果、提供实验报告
分析实时定量PCR结果，根据标准曲线定量样品中的目的microRNA。提供实验报告，包括详细的实验方法，实时定量PCR实验数据和图表。
注：用于microRNA实时定量PCR检测的RNA样品，必须高纯度、完整，没有RNase 污染（降解的样品不能用于实时定量PCR检测），同时提取方法必须保证所得样品包含完整的小RNA部分。
4. 逆转录合成cDNA
利用茎环引物逆转录合成cDNA第一链。
5. 实时定量PCR
以合成的cDNA作为模板进行实时定量PCR扩增，梯度稀释的标准同时进行实时定量PCR扩增，根据Ct值制备标准曲线。以同样的方法测定每个样品中U6 snRNA含量作为内参，校正上样误差。
6. 分析结果、提供实验报告
分析实时定量PCR结果，根据标准曲线定量样品中的目的microRNA。提供实验报告，包括详细的实验方法，实时定量PCR实验数据和图表。
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