反应条件及使用建议

l          反应混合体系配制建议：

-        一般建议至少配制比样本多一个反应体系的混合体系(例如：如需要8个样本，配制9个混合体系)。

-        建议添加无模板对照(Non-Template control，NTC) ，即添加DEPC-H₂O 取代模板。

l          Klen-Taq DNA 聚合酶

Klen-Taq DNA 聚合酶是 N-末端缺失的 Taq DNA聚合酶，相对于普通的Taq DNA聚合酶，其增加了热稳定性和DNA合成能力，提高了扩增效率。更高的热稳定性允许在更高的温度条件下打开复杂的二级结构和富含GC的模板。

l          MgCl₂ 浓度优化

MgCl2 是DNA聚合酶的一个复合因素。终浓度为3mM的MgCl2 浓度适用于大部分反应。然而，MgCl2的需求往往不尽相同，这取决于特殊的模板和引物。

建议针对合适的模板，设计3个重复反应，按下表格给的MgCl2浓度梯度。下表为50μl体系中MgCl2达到各终浓度时的需要加入的量。

根据实验结果，分析扩增效率、熔解曲线等，选择最佳的MgCl₂ 浓度用于之后的相关qPCR的实验。

l          引物设计及浓度

大多数情况下，引物终浓度为200nM是能够满足PCR反应。不过，根据特殊的模板和引物，引物终浓度可以在25 ~ 900 nM范围内进行优化。引物设计可借助于实时荧光定量PCR引物（探针）设计软件（如：Beacon Designer）。为获得最佳定量结果，产物大小最好控制在80 ~ 200bp的范围内。

l          模板浓度

过量的模板会抑制反应的进行。通常情况下，每50μl反应体系中100ng cDNA是足够的。当然特殊的基因会有所不同。

l          熔解曲线分析

建议在qPCR反应结束后进行熔解曲线分析，若仪器含有此功能。请参照仪器制造商推荐的使用方法说明。不含模板的阴性对照（NTC）用来确定反应过程中是否存在引物二聚体，含有模板的反应体系确定产物是否单一。

注：可以跑琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的特异性。

方法