外泌体转录组测序

    外泌体(Exosome)是由细胞分泌而来的微小囊泡，直径约为30-100 nm，具有杯状形态、双层膜结构，天然存在于血液、尿液、唾液、母乳和细胞培养基等生物体液中。包括肿瘤细胞在内几乎所有类型的细胞（免疫细胞、神经细胞、干细胞)，都可以产生并释放exosome。Exosome可通过细胞膜受体直接激活受体细胞，也可运输蛋白质、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA，甚至细胞器进入受体细胞，参与细胞间通讯。Exosome在免疫应答、炎症反应、血管生成、凋亡、凝血和废物处理等生理过程发挥关键作用，可作为多种疾病的早期诊断标记物，也能作为靶向药物的载体进行疾病治疗。

图1外泌体产生过程的示意图

一、实验流程

二、数据分析

1. 无参考基因组的转录组分析（De novo Transcriptome Analysis）

  数据产出统计及碱基质量评估；

  去除低质量、污染及接头序列；

  对序列进行de novo组装，并对组装效果进行统计评估；

  Unigene长度统计分析及表达丰度分析；

  样本间共有、特有及差异Unigene统计；

  Unigene功能注释：(Nt、Nr、Swissprot、Interpro、GO、KEGG数据库比对)

  Unigene差异表达及聚类分析(不少于两个样品)；

  差异Unigene的GO和pathway显著性富集分析。

2. 有参考基因组的转录组分析（Transcriptome analysis with reference genome）

  数据产出统计及质量评估

  Reads与参考基因组序列或转录组序列比对

  Reads在基因组上的分布统计

  转录本定量

  基因功能注释

  基因GO 和pathway显著性富集分析

  基因表达差异分析（不少于两个样品）及聚类分

  基因结构及变异分析：可变剪切、基因融合及cSNP鉴定等

  预测新基因

三、案例分析

外泌体转录组测序——肺移植后排斥反应的分子机制研究和新生物标志物寻找

Altered Exosomal RNA Profiles in Bronchoalveolar Lavage from Lung Transplants with Acute Rejection.Am J RespirCrit Care Med. 2015. IF=13.118

肺移植后急性排斥反应(AR)是移植物功能降低甚至丧失的主要原因，也是导致肺慢性排斥反应(CLAD)的首要危险因素之一。但AR导致CLAD的分子机制尚缺乏了解 。由肺移植细胞分泌的外泌体（exosome）含有多种不同的分子，这些分子可密切反应组织和细胞的生物学状态。 因此外泌体转录组可能有助于我们更好的理解排斥反应过程，而且源于exosome RNA(外泌体中的 RNA 也称外泌体穿梭 RNA，esRNA)的生物标志物可以及时和敏感的检测AR，助于减少严峻AR和CLAD的发生率，提高治疗效果。

　为了解肺移植后排斥反应的病理生理学和寻找生物标志物，研究者分别对有AR（n=6）和没有AR(n=6)的肺移植病人进行连续的支气管肺泡灌洗液（BALF）收集，超速离心法分离外泌体后，分别提取外泌体和BALF细胞的总RNA，通过Illumina HiSeq 2500进行测序。并对AR病人外泌体中表达上调的关键基因用同样本进行qPCR和WB验证。

结果发现AR病人和无AR病人的esRNA特征具有明显的差异。基因集分析发现esRNA主要富集在细胞通讯和基础代谢上，且肺基础代谢途径在没有AR症状的病人中高表达于AR病人，而AR病人的上调的esRNA倾向富集于炎症反应通路，包括先天和适应性免疫系统。研究还发现新的上游激活靶标，可用于潜在的治疗干预，且现有的治疗药物可能有效作用于急性排斥反应。另外，对esRNA和细胞RNA进行比较发现，RNA具有很大的差异,尤其是B细胞和T细胞相关产物。

                图1. 具有急性排斥反应的样品外泌体中上调基因的通路

三、样品要求

  血清样品：2-4ml

  外泌体样品：1ml

  RNA样品：500ng