重亚硫酸盐的测序法实验流程（BSP）

原理：结合重亚硫酸盐的测序法是一种灵敏的能直接检测分析基因组DNA甲基化模式的方法。重亚硫酸盐处理后，用针对改变后的DNA序列设计特异性引物并进行聚合酶链式反应（PCR）。 PCR产物中原先非甲基化的胞嘧啶位点被胸腺嘧啶所替代，而甲基化的胞嘧啶位点保持不变。PCR产物克隆后进行测序。通过这个方法能得到特定位点在各个基因组DNA分子中的甲基化状态。

特点：

1、特异性高，它能够提供特异性很高的分析结果，这是所有其他研究甲基化的分析方法所不能比拟的；

2、灵敏度高，可以用于分析少于100个细胞的检测样品。用微量的基因组DNA进行分析就能得到各个DNA分子精确的甲基化位点分布图。

                                                            重亚硫酸盐测序法技术实验流程

A． DNA制备

用DNA抽提试剂盒（Promega, cat. no. A1125）抽提组织，细胞培养物，石蜡包埋组织切片样品中的基因组DNA。

B．重亚硫酸盐处理

C． DNA纯化

用Wizard DNA clean‐up kit (Promega, cat. no. A7280)纯化重亚硫酸盐处理后的DNA样品。

D． PCR扩增

E． PCR产物琼脂糖电泳后回收纯化

F． PCR产物连接到pMD19‐T (Takara) 载体中克隆及测序。

G．用分析软件对各样本测序结果进行甲基化程度分析