免疫学检测技术

血清学技术

抗原抗体反应是指抗原与相应的抗体之间发生的特异性结合反应。它既可以发生在体内，也可以发生在体外。在体内发生的抗原抗体反应是体液免疫应答的效应作用。体外的抗原抗体结合反应主要用于检测抗原或抗体，用于免疫学诊断。因抗体主要存在于血清中，所以将体外发生的抗原抗体结合反应称为血清学反应或血清学试验。血清学试验具有高度的特异性，广泛应用于微生物的鉴定、传染病及寄生虫病的诊断和监测。

2 特点：

（一）特异性和交叉性?抗原抗体的特异性结合是指抗原分子上的抗原决定簇和抗体分子可变区结合的特异性，是由两者之间空间结构互补决定的。抗原与相应抗体的结合具有高度的特异性，主要依靠抗原分子上的抗原决定簇和抗体末端可变区的氨基酸排列和立体构型，只有抗原决定簇的立体构型和抗体分子的立体构型完全吻合，才能发生反应。如抗新城疫病毒的抗体只能与新城疫病毒结合，而不能与其他病毒结合。但较大分子的蛋白质常含有多种抗原决定簇，如果两种不同的抗原之间含有部分共同的抗原决定簇，则发生交叉反应。如肠炎沙门氏菌的抗血清能凝集鼠伤寒沙门氏菌。一般来说亲缘关系越近，交叉反应的程度越高。根据抗原抗体反应高度特异性的特点，在疾病诊断中可用抗原、抗体任何一方作为已知条件来检测另一未知方。

（二）敏感性
抗原抗体的结合还具有高度敏感性的特点，不仅可检测定性，还可以定量检测微量、极微量的抗原或抗体，其敏感度大大超过当前所应用的化学分析方法。

（三）可逆性
抗原与抗体的结合是分子表面的结合，这种结合是可逆的，结合条件为0℃～40℃、pH4～9。如温度超过60℃或pH降到3以下，或加入解离剂（如硫*化钾、尿素等）时，则抗原抗体复合物又可重新解离，并且分离后抗原或抗体的性质仍不改变。免疫技术中的亲合层析法，常用改变pH和离子强度促使抗原抗体复合物解离，从而纯化抗原或抗体。

（四）反应的二阶段性
第一阶段为抗原与抗体的特异性结合阶段，此阶段反应快、仅数秒至数分钟，但不出现可见反应。第二阶段为可见阶段，这一阶段抗原抗体复合物在环境因素（如电解质、pH、温度、补体）的影响下出现各种可见反应，如表现为凝集、沉淀、补体结合等。此阶段反应慢、需数分钟、数十分钟或更久。第二阶段受电解质、pH、温度等因素的影响。

（五）最适比例与带现象
大多数抗体为二价，抗原为多价，因此只有两者比例合适时，才能形成彼此连接的大复合物，血清学反应才出现凝集、沉淀等可见的反应现象（图11-1）。如果抗原过多或抗体过多，则抗原与抗体的结合不能形成大复合物，抑制可见反应的出现，称为带现象。当抗体过量时，称为前带；抗原过多时，称为后带。为克服带现象，在进行血清学反应时，需将抗原或抗体作适当稀释，通常是固定一种成分，稀释另一种成分。

（六）用已知测未知
所有的血清学试验都是用已知抗原测定未知抗体，或用已知抗体测定未知抗原。在反应中只能有一种材料是未知的，但可以用两种或两种以上的已知材料检测一种未知抗原或抗体。

3 影响因素

（一）电解质
抗原与抗体发生结合后，由亲水胶体变为疏水胶体的过程中，须有电解质参与才能进一步使抗原抗体复合物表面失去电荷，水化层破坏，复合物相互靠拢聚集形成大块的凝集或沉淀。若无电解质参加，则不出现可见反应。为了促使沉淀物或凝集物的形成，常用0.85%～0.9%（人、畜）或8%～10%（禽）的氯化钠或各种缓冲液（免疫标记技术）作为抗原和抗体的稀释液或反应液。但电解质的浓度不宜过高，否则会出现盐析现象。

（二）温度
在一定温度范围内，温度越高，抗原、抗体分子运动速度越快，这可以增加其碰撞的机会，加速抗原抗体结合和反应现象的出现，如凝集和沉淀反应通常在37℃水浴感作（即将试验材料加盖保湿恒温作用）一定时间，以促进反应现象的出现，若用56℃水浴则反应更快。但有的抗原抗体结合则需长时间在低温下，才能使反应完成的比较充分、彻底，如有的补体结合试验在0℃～4℃冰箱结合效果更好。

（三）酸碱度
血清学试验要求在一定的pH下进行，常用的pH值为6～8，过高或过低，均可使已结合的抗原抗体复合物重新解离。若pH降至抗原或抗体的等电点时，会发生非特异性的酸凝集，造成假象。

（四）振荡
适当的机械振荡能增加分子或颗粒间的相互碰撞，加速抗原抗体的结合反应，但强烈的振荡可使抗原抗体复合物解离。

（五）杂质和异物
试验介质中如有与反应无关的杂质、异物（如蛋白质、类脂质、多糖等物质）存在时，会抑制反应的进行或引起非特异性反应，故每批血清学试验都应设阳性对照和阴性对照试验。

4 实验方法：

凝集反应（agglutination reaction）

一种血清学反应。颗粒性抗原（完整的病原微生物或红细胞等）与相应抗体结合，在有电介质存在的条件下，经过一定时间，出现肉眼可见的凝集小块。参与凝集反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。可分为直接凝集反应和间接凝集反应两类。

直接凝集反应
颗粒状抗原（如细菌、红细胞等）与相应抗体直接结合所出现的凝集现象。分为玻片法和试管法。玻片法是一种定性试验方法。可用已知抗体来检测未知抗原。若鉴定新分离的菌种时，可取已知抗体滴加在玻片上，将待检菌液一滴与其混匀。数分种后，如出现肉眼可见的凝集现象，为阳性反应。该法简便快速，除鉴定菌种外，尚可用于菌种分型、测定人类红细胞的ABO血型等。试管法是一种定量试验的经典方法。可用已知抗原来检测受检血清中有无某抗体及抗体的含量。用来协助临床诊断或供流行病学调查研究。操作时，将待检血清用生理盐水连续成倍稀释，然后加入等量抗原，最高稀释度仍有凝集现象者，为血清的效价，也称滴度，以表示血清中抗体的相对含量。诊断伤寒、副伤寒病的肥达氏反应（Widaltest）、布氏病的瑞特氏反应（Wright test）均属定量凝集反应。

间按凝集反应
将可溶性抗原（或抗体）先吸附于一种与免疫无关的、一定大小的颗粒状载体的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用。在有电介质存在的适宜条件下，即可发生凝集，称为间接凝集反应。用做载体的微球可用天然的微粒性物质，如人（O型）和动物（绵羊、家兔等）的红细胞、活性炭颗粒或硅酸铝颗粒等；也可用人工合成或天然高分子材料制成，如聚苯乙烯胶乳微球等。由于载体颗粒增大了可溶性抗原的反应面积，当颗粒上的抗原与微量抗体结合后，就足以出现肉眼可见的反应，敏感性比直接凝集反应高得多。

沉淀反应(preclpltation reaction)

可溶性抗原与相应抗体结合，在有适量电介质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的沉淀物。沉淀反应的抗原可以是多糖、蛋白质、类脂等。同相应抗体比较，抗原的分子小，单位体积内含有的抗原量多，做定量试验时，为了不使抗原过剩，应稀释抗原，并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。习惯上将参与沉淀反应的抗原称为沉淀原，抗体称沉淀素。沉淀反应的实验方法大体可分为环状法、絮状法、琼脂扩散法三种基本类型。

环状沉淀又称环状试验。主要用于抗原的定性试验。用已知抗体来检测未知抗原。在小口径试管中先加入已知抗血清，然后将待检抗原小心地加在血清的表面，成为界面清晰的两层。数分钟后，两界面交界处出现白色沉淀环，为阳性反应。本试验常用做抗原定性，如炭疽的诊断（Ascoli氏试验）、鉴别血迹、媒介昆虫的嗜血性等。
絮状沉淀

将抗原与相应抗体在试管内或凹玻片上混匀，如出现肉眼可见的絮状沉淀物，为阳性反应。如诊断梅毒的康氏反应（Kahntest）。
琼脂扩散实验

利用可溶性抗原与抗体在半固体琼脂内进行扩散，若抗原与抗体对应，并且比例适当，就会出现白色沉淀线，此为阳性反应。琼脂扩散试验可在试管内、平皿中以及玻片上的琼脂中进行。又可分为单向琼脂扩散试验和双向琼脂扩散试验两类。

单向琼脂扩散试验
是一种常用的定量检测抗原的方法。将适量抗体与琼脂混匀，浇注成板，凝固后，在板上打孔，孔中加入抗原，抗原就会向孔的四周扩散，边扩散边与琼脂中的抗体结合。一定时间后，在两者比例适当处形成白色沉淀环。沉淀环的直径与抗原的浓度成正比。如事先用不同浓度的标准抗原制成标准曲线，则从曲线中可求出标本中抗原的含量。本试验主要用于检测标本中各种免疫球蛋白和血清中各种补体成分的含量，敏感性很高。

双向琼脂扩散试验
是将半固体琼脂倾注于平皿内或玻片上，待其凝固后，在琼脂板上打孔，将抗原、抗体分别注入小孔内，使两者相互扩散。如果抗原、抗体相互对应，浓度、比例适当，则一定时间后，在抗原、抗体孔之间出现清晰可见的沉淀线。双向琼脂扩散法可用来分析溶液中的多种抗原。一对抗原、抗体系统只能形成一条沉淀线，不同的抗原抗体系统在琼脂中扩散的速度不同，可在琼脂中形成不同的沉淀线。本法主要是用于检测血清中各种免疫球蛋白、甲胎蛋白、乙肝表面抗原等。缺点是需要时间过长，灵敏度不高。